鹿茸多肽复合膜提供周围神经再生的微环境

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4652-4659.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.013

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鹿茸多肽复合膜提供周围神经再生的微环境

王克利¹，路来金²，张静玲³，李相军⁴，景遐斌⁵

1 解放军第二炮兵总医院骨科，北京市 100088
2 吉林大学第一临床学院手外科，吉林省长春市 130021
3 北京科技大学医院，北京市 100086
4 吉林大学药学院病理教研室，吉林省长春市 130021
5 中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室，吉林省长春市 130021

收稿日期:2013-03-07 修回日期:2013-05-03 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
作者简介:王克利☆，男，汉族，1967年生，吉林大学白求恩医学部毕业，博士，主任医师，主要从事周围神经损伤修复的研究。 Woodpeck007@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助课题(30470833)。

Pilose antler polypeptide composite membrane supports a suitable microenvironment for peripheral nerve regeneration

Wang Ke-li¹, Lu Lai-jin², Zhang Jing-ling³, Li Xiang-jun⁴, Jing Xia-bin⁵

1 Department of Orthopedics, the Second Artillery General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100088, China
2 Department of Hand Surgery, Clinical College of Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
3 University of Science and Technology Beijing, Beijing 100086, China
4 Department of Pathology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
5 State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130021, Jilin Province, China

Received:2013-03-07 Revised:2013-05-03 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
About author:Wang Ke-li☆, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, the Second Artillery General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100088, China Woodpeck007@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30470833

摘要/Abstract

摘要：

背景：既往研究证实聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合膜具有良好的生物相容性，稳定的机械强度，无毒副作用，可控的降解速率等特点。而鹿茸多肽含有多种活性物质，主要有促进DNA合成和细胞分化的作用。
目的：观察鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合膜对大鼠坐骨神经再生的影响。
方法：手术显露36只Wistar大鼠坐骨神经，随机分成3组。假手术组游离坐骨神经后不作任何处理，对照组和实验组切断坐骨神经后行神经断端直接吻合，实验组于神经吻合断端包裹鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合膜。每组于术后第2，4，6周各取4只大鼠，分别行组织学检测、免疫组织化学检测、反转录-多聚酶链式反应检测。
结果与结论：①组织学检测：术后2，4，6周神经轴突再生率和成熟度比较，对照组<实验组<假手术组。②免疫组化检测：术后2，4，6周神经纤维轴突及髓鞘转化生长因子β1、胰岛素样生长因子抗原染色和抗原表达比较，假手术组<对照组<实验组。③反转录多聚酶链式反应：在6周时，检测出转化生长因子β1和胰岛素样生长因子 mRNA表达，假手术组<对照组<实验组。结果表明鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合膜能够提供神经再生所需要的微环境和神经生长因子，促进周围神经再生。

关键词: 生物材料, 组织工程复合支架材料, 鹿茸多肽, 聚乳酸, 聚羟基乙酸, 复合膜, 周围神经, 神经再生, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that polylactic acid-polyglycolic acid membrane has good biocompatibility, stable mechanical strength, non-toxic side effects and controllable degradation rate. Pilose antler polypeptide contains a variety of active materials, basically promoting DNA synthesis and cell differentiation.
OBJECTIVE: To investigate the repair effect of pilose antler polypeptide-polylactic acid-polyglycolic acid copolymer composite membrane on sciatic nerve injuries in rats.
METHODS: Thirty-six male Wister rats were subject to expose the sciatic nerve after surgery and then randomly divided into sham operation group, control group and experimental group. Rats in the sham operation group received no treatment after removal of the sciatic nerve; those in the control group underwent direct end-to-end nerve anastomosis; while those in the experimental group were wrapped by pilose antler polypeptide-polylactic acid-polyglycolic acid copolymer composite membrane after the end-to-end nerve anastomosis. Four rats were collected from each group, respectively, at postoperative weeks 2, 4, 6 for histological examination, immunohistochemical examination and reverse transcription-PCR detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Histological detection: 2, 4, 6 weeks after operation, the regeneration ratios and degree of maturity of neurites ranked as follows: the control group < the experimental group < the sham operation. (2) Immunohistochemical detection: 2, 4, 6 weeks after operation, the transforming growth factor β, insulin-like growth factors antigen dyeing and antigen expression of neurites and myelin sheath ranked as follows: the sham operation group < the control group < the experimental group. (3) Reverse transcription-PCR: 6 weeks after operation, the mRNA expression of transforming growth factor β and insulin-like growth factors was detected as follows: the sham operation group < the control group < the experimental group. These results suggest that pilose antler polypeptide-polylactic acid-polyglycolic acid copolymer composite membrane can provide the necessary microenvironment of nerve regeneration and nerve growth factor, and promote the peripheral nerve regeneration.

Key words: biomaterials, tissue-engineered composite scaffold, pilose antler polypeptide, polylactic acid, polyglycolic acid, composite membrane, peripheral nerve, neural regeneration, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

王克利，路来金，张静玲，李相军，景遐斌. 鹿茸多肽复合膜提供周围神经再生的微环境[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4652-4659.

Wang Ke-li, Lu Lai-jin, Zhang Jing-ling, Li Xiang-jun, Jing Xia-bin . Pilose antler polypeptide composite membrane supports a suitable microenvironment for peripheral nerve regeneration [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4652-4659.

图/表（结果） 5

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引言

周围神经损伤临床非常多见，其损伤性质不同于一般的组织损伤^[1]，现研究认为周围神经损伤实质上是神经细胞的轴突损伤^[2]。因而周围神经损伤后的功能恢复有赖于其轴突成功再生。正常的神经功能有赖于轴突的双向轴浆转运：一方面，通过顺行转运的神经介质和神经营养因子刺激神经末梢和效应器，保持所支配效应器活力与功能；另一方面，通过逆行转运的神经营养因子及神经诱导因子，从而促进神经轴突的再生和趋化、定向生长^[3-4]。由此可看出，周围神经损伤后的第一要务就是及时地恢复神经干的连续性，全力避免神经元死亡，积极促进轴突再生，有效防止效应器萎缩。

近些年，显微外科技术在周围神经损伤修复中的应用，极大的促进和改善了神经吻合理念和技术。然而，Brushart等^[5]证实单纯采用显微外科精细缝合的方法不能完全解决周围神经断裂修复后恢复不佳的问题。周围神经损伤后再生主要取决于其生长的再生微环境^[6]。周围神经受损后成功再生的首要条件就是保障神经胞体结构和功能的正常，其次就是诱导再生轴突延长穿越损伤区，最后则是轴突生长锥长入效应器找到并识别靶器官，而其中最为关键问题之一是如何提供一个有利的生长环境给损伤的周围神经，以促进其充分再生和功能恢复^[7]。

周围神经损伤修复后疗效不佳主要有两方面的原因，一是神经再生速度缓慢，待再生神经至效应器时，肌肉已发生不可逆变性。二是神经缝合口周围组织床微循环的改变可导致组织渗出、粘连、瘢痕形成，影响神经通过^[8-9]。因此，如何改善神经再生的微环境，同时提供神经生长所需的物质，从而加速神经再生，使肌肉尽早重新获得神经支配，是周围神经修复亟待解决的问题。利用可提供神经再生营养因子的生物材料修复神经，在近十年来已受到人们的高度重视。但迄今为止最佳生物材料尚未确定。为此，实验利用含有生物活性物质(鹿茸多肽)的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合膜，修复损伤的大鼠坐骨神经，探讨其对周围神经再生的影响。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2008年3月至2009年1月在吉林大学第一临床学院手外科实验室完成。

材料：

动物：健康雄性Wistar大鼠36只，体质量(250±50) g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(吉) 2003-0007，实验等级为二级。

研究鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜对周围神经再生影响的主要试剂与仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜的制备：聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物聚合膜由中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室采用溶液浇铸/粒子沥滤法制备。制作方法：先按设计要求用聚四氟乙烯制作模具，再取10 g聚乳酸和聚羟基乙酸聚合物(质量比85∶15)溶于三氯甲烷中，配成10%的溶液，混合均匀；加入30 g经研磨过筛的氯化钠颗粒(用180目和200目的目筛过滤，粒径为70-80 μm)，充分搅拌混匀后，浇注于模具中；静置24-48 h，脱模，静置24-48 h：然后真空干燥24 h；最后将材料置于去离子水中浸泡并不时搅动，每4-6 h换一次水，连续48 h，空气干燥24 h，真空干燥48 h。将鹿茸多肽粉剂与干燥的聚乳酸聚羟基乙酸聚合物充分混合制得厚度0.3 mm、长度15 mm、管壁微孔孔径70-80 μm、孔隙率约为75%的鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜。应用环氧乙烷消毒备用。

动物模型制备及分组：36只Wistar大鼠，随机分成假手术组、对照组、实验组，每组12只。1%硫喷妥钠 (5 mL/kg)腹腔注射麻醉，于大鼠的左下肢股后方显露坐骨神经。在10倍手术显微镜下，用显微剪刀游离坐骨神经约20 mm。在梨状肌下缘5 mm处切断坐骨神经后行端端直接吻合；实验组在梨状肌下缘5 mm处切断坐骨神经，将神经端端吻合后，将鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜修剪成10 mm×10 mm大小包裹于两神经断端，在薄膜两端1 mm处与两断端神经外膜各固定3针，然后在薄膜游离缘与外膜中间部分缝合数针，让薄膜形成一个封闭的导管，见图1，以上缝合均用9-0无损伤缝线。假手术组不行任何处理于术后第2，4，6周每组各取4只大鼠进行取材观测。

组织学检测：术后2，4，6周，每组取3只，1%硫喷妥钠(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，显露手术侧坐骨神经。各组以坐骨神经缝合口为中心切取10 mm长的神经组织(假手术组取相同水平组织)，远端缘用9-0无损伤缝线标记方向，体积分数10%中性甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋固定，做横断面5 μm厚的连续切片。苏木精-伊红染色，在光镜下观察。CIAS-1自动图像分析仪测定各组神经远近端轴突计数、再生轴突截面积、再生神经截面积，并计算轴突再生率和再生轴突成熟度。

免疫组化染色及半定量分析：检测各组标本转化生长因子β1、胰岛素样生长因子因子的表达。神经取材、常规石蜡包埋固定及连续切片同上。采用石蜡切片微波修复抗原染色：①载玻片防脱片剂APES处理。捞片后置烤箱(58-60 ℃)30-60 min。②切片常规脱蜡至水。③体积分数30%H₂O₂1份+蒸馏水10份混合。蒸馏水洗3次。④热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5- 10 min。冷却后PBS(pH 7.2-7.6)洗涤。⑤滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。⑥滴加适当稀释的一抗(小鼠或兔IgG，稀释浓度为 1∶200)，4 ℃过夜。PBS(pH 7.2-7.6)洗2 min×3次。⑦根据一抗的不同滴加相应的二抗工作液(IgG/Biotin)，室温孵育40 min，PBS洗3次，5 min/次。⑧滴加相应的辣根过氧化物酶(S-A/HRP)工作液，室温孵育20 min，PBS洗5 min，4次。⑨二氨基联苯胺双氧水(DAB-H₂O₂)显色：使用DAB显色试剂盒。取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混均匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5 min。⑩苏木精轻度复染。脱水，透明，封固。在光学显微镜下观察。应用图像分析系统根据染色的灰度定下同一标准，测定染色阳性的神经纤维平均吸光度(A)值。

反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)：神经取材同上。①Trizol法提取坐骨神经RNA。称取50 mg坐骨神经，在Eppendorf管中剪碎，加入Trizol试剂1 mL，提取组织总RNA。用紫外分光光度计测260 nm/280 nm的吸光度值。根据A₂₆₀值计算RNA浓度。RNA置于-20 ℃冰箱保存。②引物合成。每毫升Trizol加30-50 mg坐骨神经RNA组织，匀浆后移入Eppendorf管，室温孵育5 min，加入0.2 mL氯仿，强力振动15 s，室温(15-30 ℃)孵育20-30 min。12 000×g离心15 min(2-8 ℃)，离心后将上清(水相)移入新管。每管加0.5 mL异丙醇，室温10 min沉淀RNA。12 000×g离心10 min(2-8 ℃)。去除上清，加至少1 mL 体积分数75%乙醇。漩涡振荡后7 500×g离心5 min。空气或真空干燥RNA，加入20 μLDEPC 处理水。③将mRNA反转录成cDNA。在无核酶管中加入以下试剂：1 µL Oligo dT(500 mg/L)；1-5 µg总RNA； 1 µL dNTP(10 mmol/L)；加水至12 µL。65 ℃加热 5 min，迅速放置冰上，分别加入4 µL 5×缓冲液，2 µL 0.1 mol/L DTT，1 µLRNA酶抑制剂，1 µL SuperⅡ，短暂离心，42 ℃ 50 min，70 ℃15 min。④对cDNA 进行PCR 扩增。β-actin:上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，用这对引物可扩增出长度为318 bp的β-actin cDNA片段；转化生长因子β1：上游5′-GCT AAT GGT GGA CCG CAA CAA CG-3′，下游5′-CTT GCT GTA CTG TGT GTC CAG GC-3′，用这对引物可扩增出长度为411 bp的转化生长因子β1 cDNA片段；胰岛素样生长因子：上游5′-GGC ATT GTG GAT GAG TGT TG-3′，下游5′-GGA AAT GCC CAT CTC TGA AA -3′。引物合成后用5 mmol/L TrisCl(pH 7.6)溶解，使其终浓度均为 0.1 g/L。各取cDNA 1 µL在PCR仪上进行扩增反应。⑤PCR产物的检测和分析。取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭)3 V/cm电泳30- 50 min，紫外灯下拍照，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断进行灰度扫描。

主要观察指标：各组组织学、免疫组织化学及反转录多聚酶链式反应实验结果。

统计学分析：采用SPSS 11.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，方法为多个样本均数比较的方差分析(α=0.05，双尾)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤后的修复，一直是临床治疗中的难题。要进一步提高神经修复的效果，必须深入研究调节神经生长的微环境条件及影响因素^[10-13]。20世纪80年代，Lundborg等^[14]应用硅胶管桥接修复大鼠坐骨神经缺损，功能恢复较好，证实了应用神经导管套接形成相对密闭再生室的方法有望提高周围神经损伤后的修复效果^[15-16]。人们开始通过生物工程手段，寻找各种材料，在神经再生研究的基础上，发展神经导管桥接技术。这些神经导管由生物材料或人工合成材料制成，具有不同的物理特性^[17]。理想的神经导管首先要满足神经细胞生长所需要的基本要求^[18]：天然材料常见的是胶原、壳聚糖等可降解材料；合成材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯等可吸收材料，以及硅胶、聚四氟乙烯等不可降解材料^[19-25]。

近年来，可降解生物材料的高速发展，促使聚乳酸类高分子材料在医学上得到广泛应用，如手术缝合线、药物控制释放体系及组织修复材料等^[26]，是目前应用最广的细胞支架生物材料之一，已被美国食品与药品管理局收入药典^[27]。这次实验选用的神经导管，是聚乳酸与聚羟基乙酸以不同比例嵌段共聚而成的高分子材料，具有良好的生物相容性，长期使用体内无蓄积，生物降解可控，降解产物毒性低，且其代谢终产物为二氧化碳和水，通过新陈代谢途径排出体外，对生物体无危害，已成为药剂学、组织工程学、再生与重建医学研究的一大热点^[28]。并具有微孔，有利于物质交换和血管生长，又具有支架作用，有利于神经纤维及许旺细胞攀沿生长，类似于Bungner带，从而引导轴突延伸^[29-30]。前期实验证实该导管能够提供神经再生的微环境，能够防止神经瘤形成，避免再生神经与周围组织产生粘连^[31]。在改进神经导管制作材料的基础上，在导管内加入神经营养因子，形成具有生物活性的神经再生导管，可加速轴突再生速度^[32]。

鹿茸作为临床治疗药物在中国已有几千年的历史，但作为中药资源至今未得到科学的利用和开发。多项研究证明，鹿茸多肽在体外可明显促进神经干细胞向神经元分化^[33]，对大鼠坐骨神经损伤具有促进神经再生、加快神经轴生长的作用^[34]。Sadighi和Luetteke等^[35-36]证明在马鹿茸顶部的非骨化部位存在大量的胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ及转化生长因子β1和β2及其受体。

鹿茸多肽是从鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成分^[37]。其中含有多种生长因子如胰岛素样生长因子和其他营养成分^[38]。这次实验应用聚乳酸聚羟基乙酸加入含有多种活性物质的鹿茸多肽，制成鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜，既能改善轴突再生的微环境，又能提供神经营养因子，从而加速神经轴突再生速度。从实验结果来看，实验组神经轴突再生率和再生轴突成熟度好于对照组；实验组在各时间点，再生神经纤维轴突和髓鞘转化生长因子β1、胰岛素样生长因子表达均较高，与对照组有显著差异，并且6周时各指标均与2周时有显著差异，表明再生神经纤维数量与转化生长因子β1、胰岛素样生长因子量的变化成同步性。证实该神经修复导管中含有的鹿茸多肽能够提供大量的转化生长因子β1、胰岛素样生长因子，而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子作用于许旺细胞，刺激许旺细胞的增殖，而损伤神经的再生在很大程度上依靠大量的许旺细胞形成许旺细胞基膜管^[39]。

总之，实验证实鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜是具有生物活性的神经导管，可以应用于临床周围神经损伤的修复。

鹿茸多肽复合膜提供周围神经再生的微环境

Pilose antler polypeptide composite membrane supports a suitable microenvironment for peripheral nerve regeneration

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